A combinação do uso do citômetro de fluxo (FCM) e de anticorpo policlonal (imuno-FCM) foi comparada à microscopia de imunofluorescência (IF) e ao plaqueamento em meio de cultura semi-seletivo, para a detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap) em sementes de feijão. Concentrações de Xap variando de 10³ a 10(7) CFU/mL foram adicionados aos extratos de sementes. Um método de separação pelo citômetro de fluxo foi desenvolvido para a detecção de Xap em extratos de semente e posterior confirmação por PCR. Para avaliação da viabilidade das células foram usadas sondas fluorescentes, iodeto de propídio (PI)/carboxi diacetato de fluoresceína (cFDA) e PI/SYTO 9 e também, a combinação de imuno-FCM e PI. Em meio semi-seletivo e IF foram detectadas 10³-10(6) UFC/mL e no FCM 10(4)-10(6) UFC/mL, em extratos de sementes artificialmente infestados. Xap somente foi detectada em extratos de sementes por PCR, após o processo de separação pelo FCM. Foi possível pelo FCM a quantificação e identificação de células viáveis (verde fluorescente) e células mortas (vermelho fluorescente) de Xap, pelas sondas cFDA/SYTO 9 e PI, respectivamente. A combinação de immuno-FCM e PI poderá ser uma técnica promissora e segura para a detecção deste patógeno em sementes.

Flow cytometric analysis of immuno-stained cells (immuno-FCM) was compared to immunofluorescence microscopy (IF) and dilution plating on a semi-selective medium, for quantitative detection of Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap) in bean seed extracts. Cell concentrations of Xap between 10³-10(7) CFU/mL were added to healthy bean seed extracts. A flow cytometry sorting procedure was developed to separate immuno-stained Xap cells from crude seed extracts and confirming by PCR. FCM was evaluated for direct viable counting (DVC) of Xap using combinations of propidium iodide (PI) and carboxy fluorescein diacetate (cFDA) or PI and SYTO 9 and also the combination of immuno-FCM and PI. Dilution plating and IF allowed detection of Xap in bean seed extracts in a range of 10³-10(6) CFU/mL and immuno-FCM from 10(4)-10(6) CFU/mL. Sorted cells could be detected in crude seed extracts by PCR without further extraction. FCM also allowed quantification of viable cells of Xap after DVC procedures; the red fluorescent dye propidium iodide was used to identify dead cells in combination with the green fluorescent dyes cFDA or SYTO 9, these identifying live cells. The combination of immuno-FCM and PI could be more promising and reliable to detect this pathogen in seeds.

A determinação da viabilidade de bactérias através da técnica tradicional de plaqueamento em meios seletivos de cultura é considerada um processo longo e demorado. Os métodos baseados na atividade enzimática ou na integridade da membrana citoplasmática são mais rápidos e podem ser considerados como alternativas para acessar a viabilidade de bactérias fitopatogênicas. Este trabalho teve o objetivo de avaliar a viabilidade de suspensões de culturas puras da bactéria Clavibacter michiganensis subsp. michiganenesis (Cmm) usando as sondas fluorescentes "Calcein acetoxy methyl ester" (Calcein AM), "carboxyfluorescein diacetate" (cFDA), e "propidium iodide" (PI), em combinação com o citômetro de fluxo. Células de Cmm tratadas à temperatura de 80 °C por 30 min (não viáveis) e células não tratadas (viáveis), marcadas com Calcein AM, cFDA, PI, ou utilizando a combinação das sondas Calcein AM e cFDA com PI, puderam ser distinguidas baseado na intensidade de fluorescência através da análise do citômetro de fluxo. Células não tratadas mostraram nível elevado de intensidade de fluorescência no espectro verde, devido à coloração das células com Calcein AM ou cFDA, enquanto que as células danificadas (não viáveis) mostraram nível elevado de intensidade de fluorescência no espectro vermelho, devido à coloração com PI. O citômetro de fluxo permitiu também a quantificação rápida das células viáveis de Cmm marcadas com Calcein AM ou cFDA e das células tratadas marcadas com PI. Portanto, a aplicação do citômetro de fluxo, em combinação com sondas fluorescentes, parece ser uma técnica promissora para acessar a viabilidade de células de Cmm, quando estas são marcadas com Calcein AM ou utilizando a combinação de Calcein AM com PI.

Determination of the viability of bacteria by the conventional plating technique is a time-consuming process. Methods based on enzyme activity or membrane integrity are much faster and may be good alternatives. Assessment of the viability of suspensions of the plant pathogenic bacterium Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) using the fluorescent probes Calcein acetoxy methyl ester (Calcein AM), carboxyfluorescein diacetate (cFDA), and propidium iodide (PI) in combination with flow cytometry was evaluated. Heat-treated and viable (non-treated) Cmm cells labeled with Calcein AM, cFDA, PI, or combinations of Calcein AM and cFDA with PI, could be distinguished based on their fluorescence intensity in flow cytometry analysis. Non-treated cells showed relatively high green fluorescence levels due to staining with either Calcein AM or cFDA, whereas damaged cells (heat-treated) showed high red fluorescence levels due to staining with PI. Flow cytometry also allowed a rapid quantification of viable Cmm cells labeled with Calcein AM or cFDA and heat-treated cells labeled with PI. Therefore, the application of flow cytometry in combination with fluorescent probes appears to be a promising technique for assessing viability of Cmm cells when cells are labeled with Calcein AM or the combination of Calcein AM with PI.

A primeira fase do trabalho objetivou avaliar o efeito do tempo de deslintamento químico, 1:30 e 4:30 min, sobre o nível de infecção de Colletotrichum gossypii inoculado artificialmente em sementes de algodoeiro (Gossypium hirsutum). Sementes de algodoeiro com línter foram inoculadas com C. gossypii, mediante contato das mesmas com colônias do fungo em placas de Petri de 9 cm de diâmetro, por 30 h. Os parâmetros avaliados foram a ocorrência de fungos e o poder germinativo das sementes. Na segunda fase, o objetivo foi avaliar a influência do exsudato de sementes de algodoeiro, em função do tempo da duração do deslintamento com ácido sulfúrico, considerando-se as frações de sedimentação de sementes e diferentes condições de envelhecimento artificial sobre o desenvolvimento de C. gossypii, em condições de laboratório. As sementes foram deslintadas quimicamente com ácido sulfúrico comercial concentrado pelos períodos de 1:30 e 4:30 min, separadas em frações de sedimentação em água e submetidas ao envelhecimento artificial por 0, 72 e 96 h. Os substratos foram obtidos a partir do exsudato resultante da embebição contendo os eletrólitos lixiviados das sementes. O desenvolvimento de C. gossypii na presença do exsudato das sementes foi avaliado em meio agarizado, através da medição do crescimento micelial e da esporulação do fungo. O deslintamento químico, pelo período de 1:30 min, propiciou aumento do percentual de ocorrência de C. gossypii em sementes não-desinfestadas superficialmente, e o crescimento micelial e a esporulação do fungo foram favorecidos pelo substrato proveniente de sementes deslintadas por 4:30 e 1:30 min, respectivamente.

The present work was conducted in two phases. The first phase evaluated how the lenght of time of chemical delinting, 1:30 and 4:30 min, effected the level of infection by Colletotrichum gossypii on artificially inoculated cotton (Gossypium hirsutum) seeds. Non-delinted cotton seeds were artificially inoculated with C. gossypii by by contact with fungal colonies in Petri dishes for 30 h. The parameters evaluated were quality of health and the germination ratio. The second phase aimed at evaluating the influence of cotton seed exudates on the development of C. gossypii in function of the chemical delinting time with sulphuric acid, considering the sedimentation fractions in water and artificial aging periods of 0, 72 and 96 h in laboratory conditions. The seeds were delinted with sulphuric acid for 1:30 and 4:30 min, separated into sedimentation fractions in water and submitted to artificial aging for 0, 72 e 96 h. The substracts were obtained from the exudates containing the electrolytes leaked from the cotton seeds. The development of C. gossypii in seed exudates was evaluated in agar medium, measuring the mycelial growth and sporulation of the fungus. The results showed that chemical delinting for 1:30 min provided an increase in the incidence of C. gossypii in seeds, without superficial disinfestation. The mycelial growth and sporulation of the fungus were favoured on the substracts containing exudates of delinted seeds for 4:30 and 1:30 min, respectively.